>> 前言 <<

機體衰老是每個人隨著年齡增長都不可避免的過程，其中皮膚變化是最明顯的衰老跡象之一。細胞衰老后會分泌促炎因子，它會促進慢性炎癥發生，推動正常細胞步入衰老進程，因此它們被稱作衰老相關的分泌表型（SASP）。近年來，許多研究指出磷脂（PLs）及其氧化形式屬于 SASP 因子，在皮膚老化過程中起著至關重要的作用。其中，1-棕櫚酰基-2-花生四烯酰基-sn-磷脂酰膽堿（PAPC，圖1A）是細胞膜和脂蛋白中常見的脂質，可以作為監測皮膚老化進程的指標。PAPC中的花生四烯酸結構容易發生氧化和碎裂，產生多種氧化產物（oxPAPC，如圖1B、圖1C所示），它們密切參與了炎癥的調節過程，并在皮膚過早衰老中起到一定的作用。掌握PAPC及其氧化產物在皮膚組織中的空間分布信息對于準確揭示皮膚衰老以及其他相關疾病的作用機制具有重要的意義。

MALDI質譜成像是一種分子成像技術，它可以同時獲得組織中的幾百至上千個分子的空間分布信息。磁共振質譜（MRMS，又稱為FTICR MS）是一種超高分辨質譜技術，它能將僅有幾個mDa差異的分子區分開。將兩種技術相結合，可以精準地找出并識別年輕和衰老皮膚中PAPC和oxPAPC分子，并給出它們特異性的的空間定位信息。

圖 1. PAPC(A)和兩種氧化產物LysoSPC(B)、LysoPC(C)的化學結構

 實驗方法

將收集的31歲和63歲女性患者的OCT包埋皮膚活檢樣本制備成冷凍的組織切片（厚度10μm），附著到ITO導電載玻片上。考慮到樣本易碎性，因此不進行OCT清洗，然后在自制的升華裝置上噴涂1,5-DAN基質（密度0.26mg/cm²）。通過布魯克7T scimaX MRMS質譜儀在正離子模式下進行MALDI成像數據采集，空間分辨率為40μm和10μm，質量范圍為m/z 107-2000，瞬態約為1s，2-omega模式檢測，m/z 400的分辨率為350000。數據分析使用SCiLS? 2023a Pro進行，以基質峰面積（m/z 317.17607）對原始數據進行歸一化處理。脂質鑒定基于精確質量數，使用LipidMaps數據庫搜索（質量偏差m/z ±0.005）。

圖 2. 基于磁共振質譜的MALDI成像流程

結果與討論

圖3為PACA、LysoSPC和LysoPC三種脂質在年輕皮膚組織和年老皮膚組織的空間成像熱圖。PCPA（m/z 782.56933，質量偏差為0.13ppm）主要分布在年輕的皮膚組織中，而在年老的皮膚中含量較低，說明它會隨著時間的推移被逐漸氧化消耗掉；而其氧化產物LysoSPC (m/z 524.37100，質量偏差為0.13ppm）和LysoPC（m/z 496.33980，質量偏差為0.08ppm）在年老的皮膚組織中明顯含量更高，且具有顯著的空間分布差異。此外，可以看出LysoPC在皮膚組織、特別是真皮上層細胞中含量較高，可能的原因是LysoPC為PAPC的最終氧化產物。

圖 3. 年輕皮膚組織和年老皮膚組織的40μm空間分辨的離子熱圖對比

磁共振質譜（MRMS）技術具有無與倫比的質量分辨率，它揭示出在PAPC譜峰的附近、僅3.4mDa相差的質量位點存在另一種“隱藏的”分子（m/z 782.56578 ± 1ppm）；圖4B顯示了該分子的空間分布，與PAPC（圖4A）具有顯著的差異，進一步佐證了它們為兩種不同的生物分子。通過LipidMaps搜庫，初步確定了該未知組分可能為磷脂酰膽堿（PC 34:1）或磷脂酰乙醇胺（PE 37:1）的加鈉形式；若要進一步鑒定這種成分，需要采集二級譜圖、通過產生的脂質頭部官能團進行確認。圖4C還給出了常規TOF類質譜儀的MALDI成像模擬結果。這類質譜儀的質量分辨率通常為40000-60000，無法有效區分質量相差僅為3.4mDa的兩個分子，因此會給出錯誤的離子成像熱圖。

圖 4. 年輕皮膚組織和年老皮膚組織的40μm空間分辨的離子熱圖對比

 結  論 

布魯克的磁共振質譜儀（MRMS）可用于質量范圍m/z 100-1,500的小分子的MALDI成像分析，它在寬質量范圍內具有超高的質量分辨率和亞ppm級的質量精度。在本文的示例中，它對僅有mDa質量差異的分子實現了特異性的空間成像分析，深度挖掘出了其它類型質譜儀所不能提供的“隱藏的”分子信息。此外，超高分辨率下還可以提供同位素精細結構（IFS），為分子式的確認提供了重要的信息支撐。

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參考文獻

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